三、自噬过程进行观察和检测1、观察自噬体的形成由于自噬体属于亚细胞结构，细胞实验外包，普通光镜下看不到，因此，直接观察自噬体需在透射电镜下。Phagophore的特征为:新月状或杯状，双层或多层膜，有包绕胞浆成分的趋势。自噬体(AV1)的特征为:双层或多层膜的液泡状结构，内含胞浆成分，如线粒体、内质网、核糖体等。自噬溶酶体(AV2)的特征为:单层膜，胞浆成分己降解。(autophagicvacuoloAV)2、在荧光显微镜下采用GFP-LC3融合蛋白来示踪自噬形成由于电镜耗时长，不利于监测(Monitoring)自噬形成，人们利用LC3在自噬形成过程中发生聚集的现象开发出了此技术。无自噬时，GFP-LC3融合蛋白弥散在胞浆中;自噬形成时，GFP-LC3融合蛋白转位至自噬体膜，在荧光显微镜下形成多个明亮的绿色荧光斑点，一个斑点相当于一个自噬体，可以通过计数来评价自噬活性的高低。3、利用WesternBlot检测LC3-II/比值的变化以评价自噬形成自噬形成时，胞浆型LC3(即LC3-I)会酶解掉一小段多肽，转变为(自噬体)膜型(即LC3-ID，因此，LC3-II/比值的大小可估计自噬水平的高低。(注意:LC3对LC3-II有更高的亲和力，细胞实验外包公司，会造成假阳性。方法2和3需结合使用，同时需考虑溶酶体活性的影响。)4、MDC(Monodansylcadaverine，常州细胞实验，单丹磺酰尸胺)染色:包括自噬体，所有酸性液泡都被染色，故属于非特异性的。5、CellTrackerTMGreen染色:主要用于双染色，但其能染所有的液泡，故也属于非特异性的。CellCountingKit-8（简称CCK-8）是一种基于WST-8的广泛应用于细胞增殖和细胞毒性的检测试剂。WST-8【化学名：2-(2-甲氧ji-4-硝ji苯ji)-3-(4-硝ji苯ji)-5-(2，4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐】，是一种类似于MTT的化合物，它在电子载体1-甲氧ji-5-甲ji吩嗪鎓硫酸二jia酯（1-MethoxyPMS）存在的情况下，被线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的橙黄色甲瓒产物（formazan）。细胞增殖越多越快，颜色越深；细胞毒性越大，则颜色越浅，对于同样的细胞，颜色的深浅与活xi胞的数量成正比，因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡流式细胞术检测细胞周期：细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞开始RNA和蛋白质的合成，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。结果示例：图A细胞周期检测图；B细胞凋亡检测图细胞实验外包公司-常州细胞实验-英瀚斯生物科技由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。细胞实验外包公司-常州细胞实验-英瀚斯生物科技是南京英瀚斯生物科技有限公司今年新升级推出的，以上图片仅供参考，请您拨打本页面或图片上的联系电话，索取联系人：戴经理。)