全转录组测序全转录组是指特定组织或细胞在特定状态下所有转录产物的总和，包括mRNA和各种noncodingRNA。我们知道生物体本身的转录过程是一个动态变化且十分复杂的分子作用网络，如果只是对某个单一RNA分子的研究，有时并不能准确的发现分子作用机制。而竞争性内源RNA(ceRNA)理论阐述了一种全新的转录调控模式：ceRNA（包括lncRNA、circRNA、mRNA、假基因等）分子能够通过miRNA应答元件（microRNARespeElement，MRE）竞争性地结合相同的miRNA来调节彼此的表达水平。举个例子：miRNA会导致基因沉默现象发生，而如果lncRNA竞争性结合了miRNA，从而影响了miRNA基因沉默功能实现。ceRNA是目前转录调控领域的热点内容之一，实时定量pcr，通过全转录组研究能够系统性的阐述ceRNA的分子作用机制。目前对全转录组简便的方法就是构建2个测序文库分别进行测序。标准的生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA、miRNA各自的研究内容，靶向调控网络、ceRNA网络、共表达网络分析可以将这几种RNA联合起来分析，从而发现新的调控网络模型。去除rRNA的链特异性文库，含有的RNA信息含量十分丰富，通过测序和生物信息学分析能够得到mRNA、lncRNA、circRNA的鉴定及注释信息。不过该文库构建时会进行片段化选择从而滤掉了smallRNA的信息，所以需要另外再构建一个smallRNA文库，进行测序分析后可以得到miRNA和其他smallRNA的鉴定及注释信息。全转录组测序方案路线图如下所示：蛋白质双向电泳实验流程1.三氯yi酸-bing酮沉淀法提取蛋白2.双向电泳分离待测样品(1)一相等电聚焦前处理按照所用仪器的厂商提供操作手册进行。蛋白质上样浓度不要超过10mg/mL，否则会造成蛋白质的聚集或沉淀。(2)等电聚焦完毕后(约需24hr），若不立即进行第二相电泳，胶条可夹在两层塑料薄膜中于-70℃保存数月。(3)等电聚焦好的胶条按厂商提供的操作手册平衡两次。平衡完毕后，于电泳仪上用12.5%SDS-PAGE凝胶进行电泳分离。仪器设置为2.5W/胶45min，15W/胶5-8hr，20℃。3.银染法对凝胶进行染色(1)固定(2)清洗(3)增敏(4)清洗(5)染色(6)清洗(7)显影(8)定影(9)水洗3.凝胶扫描及图像分析(1)图像扫描：凝胶染色后采用Imagescanner以300dpi，16-bit模式（65536灰阶）进行扫描。(2)图像分析：扫描完毕后，凝胶继续置于1%yi酸中于4℃保存。扫描后的图像用ImageMaster2DPlatinumsoftware软件进行分析。分析按照软件厂商提供的说明书进行。以zui小点面积30，平滑度2为主要参数zui大限度检测蛋白质点。以目标蛋白质3个重复具有相同趋势，dna检测，目标蛋白质相邻位点的相对一致性，pcr实验室，至少2个重复有2倍以上差异作为判定差异表达蛋白质的标准。甲l基化特异性的PCRHerman等（1996）在使用重亚硫酸盐处理的基础上新建的一种方法。该方法敏感性高，主要用于作定性研究。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧定被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧定不变；随后设计针对jia基化和非jia基化序列的引物进行PCR。通过电泳检测MSP扩增产物，如果用针对处理后jia基化DNA链的引物能得到扩增片段，pcr，则说明该位点存在jia基化；反之，说明被检测的位点不存在jia基化。特点：适用范围广，能够检测特异位点是否发生jia基化。亚硫酸氢盐测序法（BisulfitesequencingPCR，BSP）亚硫酸氢盐修饰后测序法（BSP）Frommer等（1992）提出的研究DNAjia基化方法，此方法可靠性及jing确度高，能明确目的片段中每一个CpG位点的jia基化状态。用亚硫酸氢盐处理基因组DNA，所有未发生jia基化的胞嘧ding被转化为尿嘧ding，而jia基化的胞嘧ding不变。随后设计BSP引物进行PCR，在扩增过程中尿嘧定全部转化为胸腺嘧定，zui后对PCR产物进行测序就可以判断CpG位点是否发生jia基化，称为BSP-直接测序法。将PCR产物克long至载体后进行测序，可以提高测序成功率，这种方法称为BSP-ke隆测序法。特点：jing确度高，能够准确检测出jia基化的程度百分比。实时定量pcr-pcr-英瀚斯生物科技公司由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司实力不俗，信誉可靠，在江苏南京的技术合作等行业积累了大批忠诚的客户。英瀚斯带着精益求精的工作态度和不断的完善创新理念和您携手步入辉煌，共创美好未来！)