细胞ELISPOT检测1．培养板的预处理：在24孔培养板内加0.5ml0.2%戊er醛，37℃，4h，弃掉板中的处理液，用PBS洗涤3次，每次3min；2．抗原包被：将适量抗原溶于包被缓冲液中，每孔加入0.5ml，4℃过夜，PBS-T洗涤3次，每次3min；3．制备细胞悬液：将待测已致敏小鼠处死，取出pi脏，置于加有Hanks液的平皿内，用钝头直角9号zhu射器针头破少许脾被膜后，赶出细胞，用毛细吸管轻轻吹散细胞团后，将悬液通过250目尼龙网，取滤液，细胞实验外包，1000r/min离心5min，Hanks液洗涤3次，计数细胞后，用1640液重新悬浮细胞，细胞实验外包费用，配成所需浓度；4．往各孔中加入0.5ml含不同浓度（104-106/ml）的细胞悬液，置37℃，5％CO2条件下孵育2-4h，弃掉培养液，PBS-T洗涤3次，每次3min；5．往各孔中加入0.5ml生物素化抗ti（Bio-Ab）（2μg/ml），37℃孵育1h或4℃过夜，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；6．加入辣根过氧化物酶结合的亲合素（Avi-HRP）（2μg/ml），徐州细胞实验，37℃孵育30min，弃掉液体，PBS-T洗涤3次，每次3min；7．配制明胶-底物液：在37℃水浴中，将2.5mlTMB溶液（4mg/mljia醇溶液）滴加入7.5ml10%明胶溶液（用pH5.0磷酸钠-柠檬酸缓冲液配制）边加边搅，溶液呈白色，加入14μl3%H202；8．显色与计数：将培养板底冰浴，每孔加入0.6ml明胶-底物液，约3min，混合液凝固，将培养板取出，置室温5min，将板倒置，用肉眼和低倍放大镜计数所显示出的颜色的斑点。透射电镜自噬小体检测胰酶消化，收集作用后的细胞，离心，先将细胞块固定在2.5%成二醛和0.1%的PBS溶液中保存在4C中过夜。再用乙醇梯度脱水，接下来用环氧树脂浸透并切成薄片。随后超薄切片用铜网固定，后用重金属醋酸双氧铀和柠檬酸铅染色。通过TEM分析凋亡细胞内超微结构变化，拍照保存。贴壁细胞:先倒出培养液，采用胰蛋白酶消化或者用细胞刮(会产生碎屑)刮下:带培养液进行离心，100-1500/mim510min。离心完毕倒出培养液。管底的细胞团不要打散，沿管壁倒入适量(一般为材料体积的5-10倍)的2.5-3.5%成醒固定液，固定约1h-2h.也可在4C冰箱过夜。关于细胞冻存的注意事项：1.为保持细胞大存活率，一般都采用慢冻存融的方法。2.冻存物距液氮面越近温度越低。标准的低冻速度为－1℃~12℃/分钟，当温度下降达－25℃时，下降速度可增至－5~－10℃/分钟，到－100℃时则可迅速冻入液氮中。因此要适当掌握冻存物下降入液氮中的速度，过快能影响细胞内水分透出，太慢则促冰晶形成。3.初次冻存者在下降冻存时，细胞实验外包公司，宜先用细木棒伸入罐中探测液面位置，然后需用温度计与冻存物并行的办法，以观测下降冻存物的速度、冻存物与液氮液面距离和温度三者关系，当已掌握以上各参数和冻存技术熟练后，仅按下降时间和下降距离便可获理想冻存效果。细胞实验外包费用-英瀚斯(在线咨询)-徐州细胞实验由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司为客户提供“组织病理,细胞生物,分子生物学平台,动物模型科研外包服务”等业务，公司拥有“英瀚斯”等品牌，专注于技术合作等行业。，在江苏省南京市栖霞区和燕路371号东南大学国家大学科技园科创楼A301的名声不错。欢迎来电垂询，联系人：戴经理。)