RNA提取预备工作RNA酶（Rnase）是导致RNA降解主要的物质。此酶非常稳定，在一些的条件下只可暂时失活，但限制因素去除后又迅速恢复活性。常规高温高压灭菌方法和蛋白抑制ji不能使所有的Rnase完全失活。1.它广泛存在于人的皮肤上，因此制备RNA时必须戴手套2.RNase的又一污染源是取液器。根据取液器制造商的要求对取液器进行处理。一般情况下采用以DEPC配制的70%乙醇擦洗取液器的内部和外部，可基本达到要求。3.塑料制品、玻璃和金属物品的处理（1）塑料制品：尽量使用一次性无菌塑料制品。已标明RNase-free的塑料制品，如没有开封使用过，通常不必再处理。15.测序发现引物有突变是怎么回事？答：测序发现引物区域有突变，特别是40个碱基以下的引物，发生的概率不大，但是肯定也会发生。用户一般可以放心，引物序列一般都是通过电脑直接将您的序列COPY到合成仪的，碱基输错的机会不多。核酸合成公司一般会有一套控制办法，预防碱基输入错误。发生这种突变的原因有很多解释，人们还没有办法解决这个问题。引物合成的固相合成原理都一样，实时定量pcr，采用的机器也基本相同，合成主要原料都是由可数的几家跨国公司提供的，所有每个合成服务商遇到的问题也基本类似，没有人可以超脱。引物合成是一种多步骤的化学反应，合成也就是99%，副产品不可以避免。引物序列中插入突变往往是碱基重复，一般认为，偶连过程中，正在偶连的部分单体发生丢失DMT，导致单体又接了上去，故发生插入同一碱基的突变。至于缺失突变，一般认为是一般认为是带帽(capping)反应不造成的，Caping反应主要是封闭数5′-羟基没有参加反应单体。被封闭的引物，在下一轮偶连时将不能继续参与合成。对于碱基置换的突变，pcr，产生的原因一般认为是碱基不能100%脱保护，即引物上可能含有残留保护基团，引物的这些区域不能很好地与互补链配对，当扩增的产品被亚转化到大肠中，可能被细菌中修复系统补上了非配对的碱基。置换突变通常发生在G转换成其它碱基。碱基G在一定条件下可以转化为烯醇异构体（脱呤），2，6diaminopurine，DNA和扩增过程中DNA聚合酶将2，6diaminopurine看作碱基A，测序就会发现碱基G-A置换。脱呤现象在富含呤的引物中发生的频率较高。脱呤的引物在引物后处理脱保护阶段如果被降解，测序就会发现碱基G或A的缺失。引物合成过程中，造成碱基插入，缺失，置换突变的因素客观存在，有不少降低发生的频率建议和措施，PCR实验室，但是这些措施还停留在实验室阶段，还没有能够应用到规模化生产中。DNA测序检测1.PCR测序反应(1)取0.2ml的PCR管，用记号笔编号，将管插在颗粒冰中，按下表加试剂:所加试剂测定模板管标准对照管BigDyeMix1μl1μl待测的质粒DNA1μ1pGEM-3Zf(+)双链DNA-1μ1待测DNA的正向引物1μ1M13(-21)引物-1μ1灭菌去离子水2μ12μ1总反应体积5μ1，不加轻矿物油或石蜡油，盖紧PCR管，用手指弹管混匀，pcr实验室，稍离心。(2)将PCR管置于9600或2400型PCR仪.上进行扩增。98C变性2min后进行PCR循环，PCR循环参数为96C10s，50C5s，60°C4min，25个循环，扩增结束后设置4C保温。2.乙醇法纯化PCR产物(1)将混合物离心，将扩增产物转移到1.5mlEP管中。(2)加入25μ1/乙醇混合液，充分振荡，置冰上10min以沉淀DNA。12000r/min于4C离心30min，小心弃上清。(3)加70%(V/V)的乙醇50μ1洗涤沉淀2次。12000r/min于4C离心5min，小心弃上清和管壁的液珠，真空干燥沉淀10~15min。3.电泳前测序PCR产物的处理。(1)加入12μ1的TSR于离心管中，剧烈振荡，让其充分溶解DNA沉淀，稍离心。(2)将溶液转移至盖体分离的0.2mlPCR管中，稍离心。(3)在PCR仪上进行热变性(95C2min)，冰中骤冷，待_上机。4..上机操作按仪器操作说明书安装毛细管，进行毛细管位置的校正，人工手动灌胶和建立运行的测序顺序文件。5.仪器将自动进行序列分析，并可根据用户要求进行序列比较。如测序序列已知，可通过序列比较以星号标出差异碱基处，提高工作效率。6.测序完毕按仪器操作规程进行仪器清洗与保养。实时定量pcr-pcr-英瀚斯生物科技由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司是从事“组织病理,细胞生物,分子生物学平台,动物模型科研外包服务”的企业，公司秉承“诚信经营，用心服务”的理念，为您提供更好的产品和服务。欢迎来电咨询！联系人：戴经理。)