软gu细胞培养(1)豚鼠脱颈处死，备皮，用75%酒精消毒背部及四肢皮肤。(2)无菌操作下取下双侧股骨头及膝关节(保留周围肌肉，细胞实验外包选哪家，软gu不能暴露)，75%酒精浸泡5分钟，转移至PBS缓冲液中，带入超净工作台，剔除关节周围附着的软组织，打开髋、膝关节，用尖刀削取关节软gu组织，置入装有PBS缓冲液的无菌培养皿，防止软gu组织被风干。(3)PBS缓冲液充分漂洗软gu小块3次，细胞实验外包哪家好，然后用小剪刀将软gu块切碎至约Imm3大小。(4)再次用PBS缓冲液冲洗3次，滤干，将细小的软gu块置入放有0.2%的II型胶原酶3ml的广口瓶里，摇匀后置于37°C恒温震荡箱中消化，40分钟后将上层消化液转移至15ml规格离心管中，800r/min离心5min，收集细胞(沉淀物)，加入含10%的胎牛xue清DMEM培养液4ml并吹打混匀，制成软gu细胞混悬液。(5)把消化所得的软gu细胞混悬液收集于离心管中，经滤网过滤后用细胞计数板计数，并把细胞混悬液密度调整为2x105/ml接种于25cm2规格的培养瓶中。将培养瓶放置于CO2培养箱内。培养条件为37°C、5%CO2。(6)未消化完的软gu小块继续用II型胶原酶如_上法消化，直至软gu块基本消失。(7)每日在倒置显微镜下观察软gu细胞生长情况并拍照保存。细胞实验介绍——流式细胞术检测细胞周期和凋亡流式细胞术检测细胞周期：细胞周期：指细胞从前一次分裂结束起到下一次分裂结束为止的活动过程，通常由G0/G1期、S期、G2期和M期组成。G0/G1期：有丝分裂发生，细胞分裂成两个细胞，进入下一个细胞周期，或者进入静止期（G0期），而G0期从DNA含量上无法与G1期区分，细胞实验，细胞开始RNA和蛋白质的合成，细胞实验外包，但DNA含量仍保持二倍体。S期：DNA开始合成，细胞核内DNA的含量介于G1期和G2期之间。G2期和M期：当DNA成为4倍体时，细胞进入G2期。G2期细胞继续合成RNA及蛋白质，直到进入M期。PI法是经典的周期检测方法。PI为插入性核酸荧光染料，能选择性的嵌入核酸DNA和RNA双链螺旋的碱基之间与之结合，其结合的量与DNA的含量成正比例关系，用流式细胞仪进行分析，就可以得到细胞周期各个阶段的DNA分布状态，从而计算出各个期的百分含量。一般流程：细胞收集-70%酒精固定过夜-PI染色-流式细胞仪检测。细胞凋亡：细胞凋亡的早期就有细胞膜表面破损发生。破损时凋亡细胞表面的磷脂腺丝氨酸(PS)可以从细胞内膜翻转至细胞的外膜。该过程发生在之前，检测PS的表达，能反映早期凋亡。AnnexinV是Ca2+依赖的磷脂结合蛋白，对PS有很高的亲和性，并且可以与暴露于细胞外的PS相结合。利用这一原理，可以将AnnexinV标记荧光来识别早期的细胞凋亡。通常利用AnnexinV-FITC和碘化丙啶(PI)来区分凋亡和坏死细胞。PI的膜通透性很差，因而只能标记坏死的细胞。一般流程：细胞收集-PI-AnnexinV标记-流式细胞仪检测。结果示例：图A细胞周期检测图；B细胞凋亡检测图细胞实验介绍——慢病毒建立稳转细胞系慢病毒包装：公司使用3质粒慢病毒包装系统，慢病毒系统使用pLKO.1-EGFP、psPAX2、pMD2.G，过表达慢病毒系统使用pLVX-AcGFP、psPAX2、pMD2.G三质粒系统，将质粒混匀后使用磷酸钙转染方法转染至HEK293T细胞中，培养48h后，收集上清。使用genecopo公司慢病毒颗粒纯化试剂盒将慢病毒纯化。纯化后留取部分检测病毒滴度，其余病毒冻存于-80℃冰箱中。滴度检测：将病毒颗粒使用梯度稀释，分别293T细胞，72h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况。根据细胞荧光量计算病毒滴度。细胞：在病毒前一天对细胞进行计数，接种约10000个细胞于12孔板中，培养过夜后使用无培养基稀释病毒，加入12孔板中对细胞进行，病毒数量根据推荐细胞的MOI加入（若无推荐MOI，需做病毒梯度：1，5，10，50，1005个梯度对细胞），6h后去除含病毒溶液，加入完全培养基细胞培养，培养48h后，在荧光显微镜下观察细胞荧光强度。同时加入puromycin对细胞筛选，筛选约2周时间。细胞筛选好后，使用定量PCR和Westernblot检测目的基因的稳定表达情况。实验流程：慢病毒质粒构建-HEK293T细胞培养-质粒转染293T细胞-病毒收集-病毒纯化-病毒滴度检测-细胞-稳转细胞筛选-稳转细胞鉴定结果示例：图A病毒滴度检测；B目的细胞病毒效果图细胞实验外包-细胞实验-英瀚斯生物科技(查看)由南京英瀚斯生物科技有限公司提供。南京英瀚斯生物科技有限公司在技术合作这一领域倾注了诸多的热忱和热情，英瀚斯一直以客户为中心、为客户创造价值的理念、以品质、服务来赢得市场，衷心希望能与社会各界合作，共创成功，共创辉煌。相关业务欢迎垂询，联系人：戴经理。)